Menurut Margino (1998) cit Worang (2001) penelitian ini meliputi beberapa tahap:
1. Persiapan medium
Untuk pembuatan medium Potato Dextrosa Agar dengan menggunakan jagung 2 bonggol yang direbus dengan aquades sebanyak 1000 ml dan didiamkan semalam. Kemudian kentang yang dikupas 300 gram dan dipotong bentuk dadu. Air rendaman jagung 1 liter digunakan untuk mendidihkan kentang selama 30 menit. Kemudian disaring untuk mendapatkan filtrat volume sebanyak 1 liter. Selanjutnya ke dalam filtrat ditambah 20 gram glukosa dan 15 gram agar. Kemudian dipanaskan dan dimasukkan autoklaf 15 menit pada tekanan 1 atm ( Atlas, 1995). Diatur pH antara 5 – 7,5 ( Atlas, 1995).
Untuk pembuatan PDB ( Potato Dextose Broth) seperti dalam pembuatan PDA tetapi tanpa menggunakan agar.
Pembuatan Sabouraud Agar dengan glukosa 40 gram, pepton 10 gram dan agar 15 g dalam 1 liter aquades Semua bahan dicampur dan ditambahkan aquades, diatur pH 5,6. Sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 20 menit.
2. Persiapan jaringan tumbuhan.
Sampel ranting tumbuhan yang sehat diambil dari spesies tumbuhan dengan jalan memotong ranting yang disertai beberapa bagian dari daun. Tiap tumbuhan diambil, 3 potong ranting dengan ukuran 2-5 mm dan 3 potong daun berdiameter 4 mm. Semua diambil pada bagian pangkal, tengah dan ujung. Sampel kemudian disimpan dalam kantong plastik tertutup untuk mengurangi penguapan. Sampel segar secepatnya diteliti atau disimpan dalam lemari es untuk beberapa saat sampai digunakan.
3. Sterilisasi permukaan.
Akar, daun dan ranting dibesihkan dengan air mengalir selam 10 menit untuk menghilangkan kotoran pada permukaan. Kemudian disterilisasi pada Ethanol 75 % selama 1 menit, Clorox 65 % selama 10 menit, Ethanol 75 % lagi selama 30 detik dan aquades. Dibersihkan dengan tisue steril. Kemudian masing-masing dibelah membujur dengan pisau steril. Diinkubasikan 2-3 hari dalam temperatur kamar.
4. Isolasi fungi endofit
Pemurnian isolat dilakukan beberapa dengan cara memindahkan jenis-jenis fungi yang nampak berbeda ke petri baru. Bila sudah diperoleh biakan murni, selanjutnya fungi dipindahkan ke media PDA miring.
5. Peremajaan isolat
Peremajaan biakan dilakukan dengan cara goresan pada medium PDA untuk isolat fungi endofit dan Sabouraud agar untuk Candida albicans. Masing-masing ditempatkan pada media agar miring dan diinkubasikan pada temperatur kamar selama 2-4 hari.
6. Percobaan penumbuhan bersama.
Sabouraud Agar dicairkan dan dibiarkan dalam suhu 50 0 C. Suspensi biakan Candida albicans dibuat dengan cara menginokulasikan 10 ml Sabouraud Agar dengan satu ose biakan murni. Setelah memadat isolat fungi endofit berupa fragmen hifanya ditempatkan pada permukaaan petri dan diinkubasikan selama 2 x 24 jam. Diperhatikan adanya zona jernih berarti ada penghambatan terhadap organisme uji.
7. Pengukuran pertumbuhan isolate fungi endofit
Setelah ditemukan fungi yang mampu menghambat diukur pertumbuhan guna mengetahui saat yang tempat pada saat pengunduhan. Kultur murni isolat kemudian diinkubasi dalam medium Potato Dextrose Broth untuk melihat fase-fase pertumbuhannya. Sebagai starter diambil spora dan miselium dari isolat murni dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu kamar dalam incubator shaker dengan kecepatan 120 rpm. Pelet yang diperoleh kemudian diambil 5 gram dan dimasukkan dalam 50 ml PDB dan diinkubasi dalam suhu kamar selam 6 hari. Fase pertumbuhan diukur dengan menggunakan berat kering selama jam ke 0, 6, 12, 24 dan tiap 24 jam sampai 6 hari. Pemisahan pelet dari medium dengan menggunakan Whatman dalam corong sehingga diperoleh filtrat untuk digunakan dalam percobaan selanjutnya. Pada saat pengukuran berat kering juga dilakukan pengukuran pH
8. Uji produksi senyawa antibiotika.
a. Pemisahan filtrat dan biomasa sel
Pemisahan biomasa sel dilakukan dengan menggunakan sentrifuge pada kecepatan 3500-5000 rpm selama 20 menit dalam tabung ependorf steril dan dipergunakan sebagai bahan pada pengujian antibiotika .
b. Pengujian biologi senyawa antibiotika .
Pengujian biologi senyawa antibiotika dilakukan dengan menggunakan metode Paper Disc Agar Diffusion Technique. Sesudah supernatan dari hasil sentrifuge media PDB tiap fase pertumbuhan disiapkan, paper disc dengan diameter 8 mm yang sudah steril dicelupkan ke dalamnya. Untuk mengurangi ekses air, disc dikeringanginkan di atas kaca steril selama kurang lebih satu jam. Disc kemudian ditempatkan di atas medium dalam cawan petri yang telah diinokulasikan secara taburan dengan mikroorganisme uji. Medium dan cara inkubasi disesuaikan dengan mikroorganisme uji. Sabouraud Agar digunakan untuk menguji Candida albicans dan diinkubasikan dalam temperatur kamar selama dalam 24 jam. Aktivitas antibiotika sampel ditunjukkan dengan adanya zona jernih di sekitar paper disc yang mencerminkan penghambatan pertumbuhan pertumbuhan jasad indikator dan diukur diameter dalam satuan milimeter. Pengukuran luas zona penghambatan dihitung dari pusat paper disc-nya.
Identifikasi fungi
Identifikasi fungi dilakukan terhadap fungi yang menghasilkan antibakteri secara morfolagi berdasarkan Alexopaulus dan Wims ( 1979) dan Ahno (2001)
No comments:
Post a Comment